Estima-se que os agentes patogénicos virais e bacterianos causem perdas bilionárias anuais à indústria do camarão em todo o mundo. Segundo a FAO, o subsector do cultivo de crustáceos representa cerca de 30% do lucro total gerado pela indústria da aquacultura, e a produção do camarão-branco-do-pacífico (Litopenaeus vannamei) gera um valor de aproximadamente 25 mil milhões de dólares por ano. De acordo com a OIE, o principal problema de saúde que o setor enfrenta é a incidência de doenças de etiologia viral. Dos 10 agentes patogénicos listados pela OIE, 7 são de origem viral. Entre os agentes patogénicos bacterianos listados, destaca-se a bactéria Vibrio parahaemolyticus, agente causador da doença da necrose hepatopancreática aguda (AHPND). Epizootias periódicas destas doenças causaram grandes perdas económicas, estimadas em mais de 15 mil milhões de dólares nas últimas três décadas. O desafio de desenvolver uma carcinicultura sustentável tem sido posto à prova devido ao aparecimento periódico de novos agentes patogénicos virais e bacterianos ou à presença de estirpes mais letais dos já conhecidos.
Considerando este contexto, o projeto ChlamyR7 iniciaria estudos sobre estratégias terapêuticas de células inteiras utilizando moléculas efetoras de RNAi expressas em microalgas. O ChlamyR7 baseia-se na combinação sinérgica de diferentes abordagens enquadradas no paradigma da biologia sintética. A primeira delas diz respeito à expressão de RNA de cadeia dupla (dsRNA) na espécie de microalga Chlamydomonas reinhardtii, o que a torna uma plataforma ideal (chassis biológico utilizado como terapêutica de células inteiras) para a administração oral de moléculas efetoras de RNA de interferência (RNAi). Além disso, o estatuto de Geralmente Reconhecido como Seguro (GRAS) da C. reinhardtii e a ausência de produção de endotoxinas e agentes infecciosos tornam-na particularmente atrativa. Ademais, devido ao método de seleção da estirpe de C. reinhardtii utilizada neste caso (TN72), que não envolve o uso de antibióticos, esta abordagem é considerada amiga do ambiente.
A segunda estratégia baseia-se no silenciamento simultâneo (RNAi) dos genes endógenos Rab7 (alvo terapêutico 1) e do fator de transcrição Fushi tarazu (FTZ) (Ftz-F1H) (alvo terapêutico 2) do camarão. O Rab7 atua como um importante fator regulador do tráfego intracelular, e o seu silenciamento inibe tanto a infeção por vírus de ADN, como o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV), como por vírus de RNA, como o vírus da cabeça amarela (YHV), o vírus da síndrome de Taura (TSV) e o vírus de Laem-Singh (LSNV). Além disso, o silenciamento do Ftz-F1H, um recetor nuclear órfão, reduziu significativamente a taxa de mortalidade dos camarões infetados por V. parahaemolyticus, bem como a carga bacteriana. Assim, o silenciamento simultâneo de ambos os genes-alvo produz um efeito antiviral multiviral e anti-V. parahaemolyticus.
Assim sendo, o nosso principal objetivo é explorar a plataforma C. reinhardtii TN72 para a produção simultânea de dsRNA antiviral multiviral e anti-V. parahaemolyticus (dsRNA-LvRab7-Ftz-F1H) para o camarão no cloroplasto, sem o uso de antibióticos como mecanismo de seleção. Em particular, pretende-se: i) Construir um plasmídeo de expressão de dsRNA utilizando um vector desenvolvido pelo grupo de Purton e gerar, por transformação de cloroplastos, uma estirpe de C. reinhardtii expressando dsRNA-LvRab7-LvFtz-F1H. Os transformantes serão genotipados por PCR e sequenciação, e o dsRNA-LvRab7-LvFtz-F1H específico será detetado e quantificado por RT-PCR e RT-qPCR; ii) Alargar a escala, realizar a colheita celular e a recuperação do produto, incluindo a secagem da biomassa microalgal para ser utilizada como tratamento oral através da mistura com alimentos (revestimento de pellets). Além disso, pretende-se iii) realizar testes de alimentação em camarão para verificar o silenciamento dos genes LvRab7 e LvFtz-F1H, bem como a inibição da replicação do WSSV e de V. parahaemolyticus, respetivamente. Finalmente, o presente estudo espera iv) desenvolver uma avaliação preliminar de risco para a geração de microalgas geneticamente modificadas. Com base na abordagem atual de avaliação caso a caso, este projeto tem como principal objetivo identificar os possíveis riscos associados à utilização desta tecnologia, tanto a nível de testes laboratoriais (silenciamento de genes off-target), como com recurso a ferramentas bioinformáticas para a determinação de possíveis organismos não-alvo no ambiente.
O projeto ChlamyR7 poderá contribuir para a criação de novas terapias orais antivirais e antibacterianas para melhorar a resposta imunitária e a resistência dos camarões. É fundamental destacar que o tratamento desenvolvido pode inibir simultaneamente pelo menos 4 dos 10 agentes patogénicos listados pela OIE (WSSV, YHV, TSV e V. parahaemolyticus). A equipa ChlamyR7 é composta por investigadores com um vasto conhecimento e experiência na modulação das respostas imunitárias do camarão (A2S-CIIMAR, Portugal) e especialistas de renome mundial em biotecnologia de microalgas (Laboratório de Purton – UCL, Reino Unido) e mecanismos de RNAi aplicados à carcinicultura (AFST-CENTEX, Tailândia).
